饮料中人工色素定性定量检测方法的研究进展

陈娅妮，蔡冲，尚袁媛，丁永合，祝迎萱，刘朝俊

中国计量大学生命科学学院（杭州 310018）

人工色素的使用越来越常态化，可以说现在食品工业的发展离不开人工色素的出现与应用。人们最早使用天然色素，后来人工色素的出现克服天然色素提取纯化复杂、量少且成本高等特点，被广泛应用于生产中。生产者按照GB 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[1]添加人工色素是合法的，然而部分生产者出于追求更加低廉的成本或使食物色泽更加诱人的目的，在食品生产中添加一些非法人工色素如苏丹红、玫瑰红B等，过量添加人工色素，这会对消费者身体健康造成损伤。因而定性定量检测产品中所添加的人工色素在市场监督中尤为重要，检测方法被科学研究者发明并加以应用，针对检测食用色素的各种方法做出分类分析，以期为人工色素的定性定量检测研究和市场对饮料中人工色素的定性定量检测提供理论依据。

为改观食品的色泽，使之诱人，食品制作过程中往往会加入一种食品添加剂——食用色素。食用色素分为天然色素和人工合成色素。天然色素因来源于植物，往往成本较高，且不太稳定，稳定性和着色度等不如人工合成色素[2]。人工合成色素又称焦油色素，来源于化工产品，如苯、萘等煤焦油，与天然色素相比，人工合成色素稳定性、着色度强且价格低廉，被广泛应用于饮料、糕点等食品行业中[3]。国家对食用色素的最大添加限量做出一系列规定，但仍有部分商家非法添加过量的人工色素，使食品从外观和口味上更加诱人。过量摄入人工食用色素，会对人体健康造成极大危害，如影响儿童的神经系统、智力生长、正常代谢，引起其行为异常；
对成人造成生育能力下降，产生的胎儿畸形；
长期食用甚至易致癌[4]。因此，对食用色素的检测开展较多研究。

目前人工色素的定性定量检测的方法有色谱法、电化学分析法、光谱法等，色谱法的应用最为广泛，可以同时检测出多种人工色素，灵敏度高但操作较复杂，且对实验设备要求较高。光谱法和电化学分析法有其独特优势，检测速度快，操作简便，但目前的应用较少，且适用于分析成分较为简单的对象。

1.1 高效液相色谱法

高效液相色谱法亦称高速液相色谱法、现代液相色谱法等，是色谱法的一个分支，其具有分离效率高、检测灵敏度高、分析速度快和选择性好等特点，被广泛应用于饮料中人工合成色素的检测。刘亚梅等[5]采用高效液相色谱法，用以快速处理并检测饮料、泡菜中赤藓红含量。结果显示，赤藓红浓度在4～40 μg/mL之间呈线性关系，相关系数为0.999 9，且回收率高、重现性好、检出限较低。

丘福保等[6]用自制的聚酰胺粉柱对7种人工合成色素柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝的混合样品富集和净化后进行高效液相检测分析，该方法适用于多种人工色素混合样品的同时检测。将高效液相色谱法与其他方法联用，亦可产生较好效果。郭占魁[7]建立一种采用固相萃取结合高效液相色谱法的方法，可同时测定饮料中9种人工合成色素。李帮锐等[8]采用高效液相色谱与质谱联用法测定饮料中的8种人工合成色素。王雪莲等[9]应用高效液相色谱-串联质谱的检测方法同时检测赤藓红、诱惑红、柠檬黄、亮蓝、靛蓝、胭脂红、苋菜红、日落黄、新红这9种人工合成色素。检测准确度、精确度、灵敏度较高，重现性好，回收率高，其中高效液相色谱和质谱联用，可消除复杂基质的干扰，能够对多种组分进行准确检测。

然而，采用高效液相色谱法进行色素的检测，前处理较复杂，需要多种大型仪器、多种试剂，对实验室要求较高，应用于现场的快速检测有一定的困难。高效液相色谱法具有高压、高速率、高效率、高灵敏度等特点，被广泛应用于卫生检验、环境保护、生命科学、农业、林业、水产科学和石油化工等领域，尤其适用于分离、分析不易挥发，热稳定性差和各种离子型化合物。对于部分有机化合物，包括永久性气体，易挥发、低沸点及中等相对分子质量的化合物则不适用高效液相色谱法进行分析。因此，对于易挥发和相对分子质量较大的人工合成色素，则不宜使用高效液相色谱法，且该方法使用多种溶剂作为流动相，成本高，易于引发环境污染[10]。

1.2 气相色谱法

气相色谱法是以气体为流动相的色谱分析方法，其具有选择性高、灵敏度高、分析速度快和分离效能高等特点，被广泛应用于沸点较低和热稳定化合物的分离与鉴定。焦糖色素是一种黑褐色的广泛使用的人工合成色素，占整个食品着色剂使用量的90%以上[11]。在以氨（铵）法生产焦糖色素的过程中，由于反应过程中的副反应，可能会产生一定量的有毒物质2-甲基咪唑和4-甲基咪唑[12]。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量的检测可通过气相色谱实现。

彭向前等[12]采用顶空进样毛细管气相色谱法同时测定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量，测得2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的线性范围分别为0.012 5～0.150 μg/mL和0.025～0.295 μg/mL，最低检测浓度分别为0.001和0.002 μg/mL，回收率高，重现性好。亦可将气相色谱法与其他方法联用，以求更好的效果。林晓珊等[13]通过气相色谱-串联质谱法测定焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的含量。王爱军[14]采用气相色谱串联三重四极杆质谱的方法测定焦糖色素中4-甲基咪唑。乔青青等[11]建立采用气相色谱-正化学源质谱法同时检测焦糖色素中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的方法。试验表明，结果均可观，操作较为简单，满足快速检测分析的需求，可用于对焦糖色素的质量控制。

气相色谱法用于分析低相对分子质量、低沸点的有机化合物、永久性气体等，是石油、化工、环境、医药、食品等领域不可或缺的工具。然而气相色谱要求试样汽化，不适用于大部分沸点高和热不稳定的化合物，仅有15%～20%的有机物能用气相色谱法进行分析。此外，气相色谱法对于条件的设置较为严苛，在进行定性和定量分析时，往往需要纯样或已知浓度的标准试样，而有些标样价格昂贵或获得比较困难[10,15]。

1.3 薄层色谱

薄层色谱（thin layer chromatography，TLC）可分为常规的薄层色谱方法和高效薄层色谱，分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质[16]。TLC是一种快速、简便、高效、经济、应用广泛的色谱分析方法，薄层色谱可单独使用，也常与傅里叶变换红外光谱、拉曼光谱、核磁共振、质谱等联用。

张兰天等[17]利用高效薄层色谱技术建立检测饮料中26种人工色素的快速定性和定量分析方法，26种人工色素的回收率在82%～103%之间，SRSD在0.9%～12.7%之间。

相较于前面几种方法，其更加简单可靠和灵活高效，适用于现场快速检测，不过高效薄层色谱（HPTLC）技术在分离能力和检测灵敏度上仍存在一定的差距。但依然不妨碍其成为轻简食品分析技术的一个重要发展方向。

1.4 超临界流体色谱

超临界流体技术（supercritical fluid chromatography，SFC）以超临界流体作为流动相，依靠流动相的溶剂化能力进行分离、分析的色谱过程。因SFC既可分析气相色谱不适应的高沸点、低挥发性的样品，又比高效液相色谱有更快的分析速度和条件，而兼具气相色谱和液相色谱的特点。SFC主要应用于小极性化合物，如农药残留、脂类维生素类的分析，在人工色素分析中应用较少，多与其他分析技术联用如质谱，但具有一定的应用前景。

宋镠[18]利用SFC建立同时测定奶油黄、日落黄、柠檬黄、萘酚黄S、固黄、丽春红3R、柑橘红2号、胭脂红、食用绿S这9种人工合成色素的SFC-DAD方法，系统优化影响分离效能的因素，包括固定相、添加剂、温度、出口压力，并对市售2种碳酸饮料（美年达、芬达）中的人工色素进行检测，可以检测到日落黄，且均小于0.1 g/kg。唐广云[19]以SFC-MS技术为基础建立可同时分析金银花、山银花中的11种极性化合物的分析方法。SFC的分离能力受较多因素影响，但相较于液相色谱，因其快速、高效、低溶剂消耗的特点而越来越受到重视。

2.1 示波极谱法

示波极谱法是一种快速加入电解电压，几秒内得出一个极谱图的电化学分析方法，多应用于微量金属元素、化学物质的快速检测。

文君等[20]通过液-液分配法从饮料、配制酒类，硬糖、蜜饯类，淀粉、软糖类中提取人工合成色素赤藓红，并用示波极谱法进行测定，检出限为0.018 62 μg/mL。张丽萍等[21]用示波极谱法检测饮料中的人工合成色素柠檬黄，并对底液的成分选择开展试验，从而提高示波极谱法检测色素的灵敏度和选择性。刘红等[22]用单扫描示波极谱法检测汽水中混合色素柠檬黄、苋菜红和胭脂红的含量，相关系数、回收率均较高。

示波极谱法检测较快速，但底液种类、用量、酸度的选择较复杂，且对于含色素产品的检测从目前研究上看仅限于成分较为简单的饮料。

2.2 毛细管电泳法

毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术，实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，能够分析到小分子水平。

相关研究[23-29]建立毛细管电泳法检测饮料中的人工色素。云凯[23]建立同时测定饮料中亮蓝、苋菜红、新胭脂红、柠檬黄及日落黄5种人工合成色素的毛细管电泳-紫外检测分析方法。王立卫[30]建立高效毛细管电泳法直接测定葡萄酒中苋菜红及亮蓝的方法。

毛细管电泳法可达到对多种人工色素的同时检测，且几十分钟即可完成，简单快速且结果可靠。毛细管电泳法与其他分离技术结合的方法也应用于人工色素的检测。常云霞[31]建立负极高压下场放大样品进样（field-amplified sample injection，FASI）结合毛细管电泳（CE）富集分离分析5种人工合成色素（日落黄、新红、偶氮玉红、柠檬黄、苋菜红）的试验方法，成功地被应用于实际样品-果冻的分析。胡江涛等[32]采用固相萃取-高效毛细管电泳法测定食品和饮料中9种禁用磺酸类偶氮色素（间胺黄、酸性嫩黄G、二甲基黄、酸性橙I、酸性橙II、酸性品红6B、丽春红2R、丽春红3R、丽春红SX）。

CE技术的分离效率高、试验经济成本低、仪器操作简易、分析方法模式多种，但该方法不适用于海盐浓度基质，目标成分痕量但复杂的分析。

3.1 分光光度法

分光光度法测定色素含量虽然操作简便、快速，但对于混合色素，产生的吸收光谱往往重叠严重，肉眼难以区别分离，需要借助一些化学计量方法进行同时测定。

王志有等[33]运用分光光度计检测柠檬黄、日落红、胭脂红的标准溶液，并借助人工神经网络（人工神经网络的研究类似于大脑的人工神经网络，通过对连续的和间断的输入作为状态反馈而完成信息处理工作，而人工神经网络算法以TURBO-O语言和编程手段，进行定量检测各组分的含量[34]）对光谱与浓度关系进行训练，可同时测定这3种色素的含量，测定市售某橙汁饮料，3种色素的回收率均达到99%左右，神经网络与最小偏二乘法比较结果均较好。孙延春等[35]对2种吸收光谱重叠严重的色素柠檬黄和胭脂红进行紫外分光光度法测定，联立方程组对柠檬黄和胭脂红进行定量分析，测得结果相对偏差小于3%。郭光美等[36]用分光光度法同时检测5种人工色素喹啉黄、诱惑红、赤藓红、淡红、靛蓝，借助最小偏二乘法建立校正模型，检出限较低，对微量色素能达到较好的检出效果。赵丽[37]基于最小偏二乘法，对立春红2R、日落黄、喹啉黄、碱性橙、酸性绿、直接绿这6种人工色素进行分光光度计测定与分析，检出限均低于3 μg/mL。

分光光度法可以直接检测多组分混合而不经分离的人工色素，检测速度较快，但检测的产品大多是色素水溶液或成分较为简单的饮料、果汁，对于复杂成分的产品中色素的检测应用较少。

3.2 荧光光谱法

荧光光谱是物质受光照射价电子被激发后，能级发生跃迁，电子又从激发态回到基态过程中所发射出的荧光为次级光。荧光光谱法具有高灵敏度和高选择性的特点，在分析检测中有着广泛应用[37]。

陈国庆等[38]发现胭脂红、苋菜红、柠檬黄、日落黄、亮蓝5种常用合成食品色素在紫外光激励下均能产生较强的荧光，且测得的荧光光谱特征明确，光谱特性与其分子结构特点对应，可以将荧光光谱分析技术应用于合成食品色素检测。孙红等[39]采用荧光分光光度法建立饮料中的合成色素胭脂红测定的新方法，胭脂红的荧光强度与浓度呈良好的线性关系，相关系数达0.994，加标回收率在94.4%～109.2%之间。胡杨俊等[40]采用荧光光谱技术与光谱模式识别方法相结合，将各类食品添加剂视为天然橙汁成分的荧光干扰物质，实现橙汁与橙汁饮料的有效鉴别。胡扬俊[41]用荧光光谱仪对市售碳酸饮料中的6种人工合成色素柠檬黄、日落黄、胭脂红、赤藓红、苋菜红、亮蓝进行三维荧光光谱的测定。

通过BP神经网络与荧光光谱结合，王俊等[42]实现对日落黄高效、痕量的检测。出于转换纳米晶与苋菜红色素溶液存在能量传递关系，曹疆艳[43]利用转换纳米晶发光强度作为荧光探针检测苋菜红色素溶液，并将制备的NaGbF4：Yb3+，Er3+@NaYF4纳米晶做成固态传感器，可用于反复检测色素含量。

但是，大多数合成色素不具有荧光特性，不能直接检测，需要构建荧光体系或借助荧光探针的方法实现定性定量测定。周尚等[44]基于苏丹红与硫酸高铈反应导致其荧光增强，采用荧光光谱法测定食品中苏丹红的含量。

荧光光谱检测具有速度快、灵敏度高的特点，但荧光光谱存在一定的内滤效应，且物质的荧光特性会受到内在结构和外在因素的影响，当溶剂背景存在较强荧光时，对被测物干扰较大，需要进行一定的分离。相较于拉曼光谱和液相色谱等技术，荧光光谱法的简便性、操作性受到局限。

3.3 近红外光谱法

近红外光谱技术具有快速、灵敏度高、操作简单、分析试样的状态不受限制、不破坏样品等特点，在食品行业上应用广泛。市面上各种饮品颜色多样，存在不少违规添加过量人工色素、掺假的现象，对消费者的身体健康造成潜在的危害，因此饮品中人工色素的快速、无损检测意义重大。

田晶等[45]采用近红外光谱技术结合统计数学处理方法构建饮料中食用合成色素的预测模型，研究发现修正的最小二乘法结合标准正态变量交换且去散射处理的光谱预处理手段建立的修正的最小二乘法模型，其预测相关系数达0.991，能较为精确地进行饮料中食用合成色素的快速无损检测。张晓伟等[46]采用近红外光谱技术结合化学计量学方法构建红曲米中红曲橙色素、红曲红色素、红曲黄色素的预测模型，结果表明近红外光谱技术可用于红曲色素的快速无损测定，为红曲米质量的智能化控制提供新途径。杨昌彪等[47]建立红酒中非法食品添加剂苋菜红的近红外光谱定性分析模型和表面增强拉曼光谱技术快速定性检测的分析方法。两方法相互结合，实现快检中交叉验证，结果准确可靠，为现场鉴别红酒是否添加苋菜红色素提供一个快速可靠的检测方法。

但是，近红外光谱技术在低含量的定量分析方法中也不是很成熟，在食品添加剂定量分析研究也较少，因此近红外光谱检测食品添加剂的技术还需要进一步完善。饮料样品属于液体，对近红外光谱区域而言，液体中水是一种极强的吸收体，它掩盖了其他成分吸收近红外光谱的信号。因此既要获得较强的待测成分的近红外信号，又要降低检测误差，这是近红外光谱技术应用在饮料中需要解决的又一问题[48]。

3.4 拉曼散射光谱法

拉曼光谱是一种散射光谱，最早由印度物理学家钱德·拉塞卡拉·文卡塔·拉曼（Chandrasekhara Venkataraman）发现。当一束单色光照射一个透明样品的时候，绝大部分入射光穿透样品，极少数发生散射；
当散射光与入射光频率基本相同时，这种散射现象称为雷利散射（Rayleigh scattering）；
当散射光部分用于样品分子的频率振动而使少量散射光与入射光频率不同的散射称为拉曼散射[49]。样品的种类不同，所产生的拉曼散射的波长也不同，所以拉曼光谱被认为是确定和鉴别分子种类的方法之一。

葛炯等[50]利用拉曼结合最小偏二乘法较准确地建立烟草中叶黄素和β-胡萝卜素的含量与拉曼散射光谱之间的定量模型，且建立的PLS模型可以可靠地预测烟草中叶黄素和β-胡萝卜素的含量，检出限为20 μg/g。可见，普通拉曼散射光谱虽然操作简便、快速，但在定量检测方面难以做到痕量。

对于人工色素的微量检测分析，表面增强拉曼光谱得到探索应用。表面增强拉曼散射（surface enhanced Raman scattering，SERS）起始于吸附在粗糙银电极表面的吡啶分子的拉曼散射比吸附在普通电极上的增强6个数量级，从而在检测微量物质的可行性体现出来。

陈宏炬等[51]用纳米金溶胶作为基底，SERS快速检测西瓜汁、不同饮料中的合成色素赤藓红，检出限达0.05 mg/kg。林爽等[52]在用表面增强拉曼光谱技术对饮料中3种色素罗丹明B、日落黄和柯衣定检测时，制备出简便、价格低的表面增强拉曼光谱滤纸基底，简便了拉曼基底增强的过程，对于色素的现场快速检测具有较大的应用前景。王乐等[53]建立基于电化学方法获得的多孔银丝基底的快速检测饮料中人工合成色素玫瑰红B的分析方法，且饮料样品无需进行前处理。邵勇等[54]基于SERS技术建立碳酸饮料和功能性饮料中碱性嫩黄O的现场快速定性、定量检测方法。陈启振等[55]用金纳米溶胶作为增强助剂对6种食品中常添加的色素亮蓝、胭脂红、日落黄、柠檬黄、苋菜红、诱惑红进行拉曼散射光谱检测，样品前处理和检测总时间较短，不超过15 min，且检出浓度在1 ml/L。周世阳等[56]借助增强剂用表面增强拉曼光谱法检测柑橘红2号色素，建立QuEChERS前处理技术与表面增强拉曼光谱结合的分析方法，检出限为1.5 mg/kg。

相较于高效液相等其他检测方法，拉曼光谱检测技术具有前处理简单、操作简便、检测时间短、无损等特点，同时便携式表面增强拉曼光谱仪为色素的现场快速检测提供较大的便利。

拉曼光谱与其他分离技术联用的检测方式可以克服拉曼检测在复杂的食品基质中易受到样品中其他组分干扰的问题，从而实现高选择性地识别检测目标分析物，如PC-SERS、MIHs-SERS、TLC-SERS等。宋雨琪[57]构建简单制作、成本低廉、便于携带的PEI@PC-SERS基底，用于碳酸饮料中电负性色素柠檬黄、日落黄和胭脂红的分离和检测。相较于传统的SERS基底，该基底克服硬质基底只适用于平面检测的缺点，便于携带用于现场检测。结合纸色谱的分离能力，PC-SERS不仅可以排除实际样品中杂质的干扰，更纯化了目标色素，提高检测的灵敏度。徐凯云[58]基于MIHs结合SERS技术，合成包含带正电荷纳米颗粒的具有高选择性和高灵敏度的新红分子印迹水凝胶用于新红的快速检测，适用于低成本的户外现场快速检测，多应用于食品中偶氮类染料。薄梦阳[59]建立TLC与SERS联用快速检测食品中的人工色素日落黄、柠檬黄和胭脂红的方法，且对正山小种、金骏眉、凤牌红茶、滇红工夫4种茶叶样品进行定性检测分析。该方法只需进行简单的前处理即实现实时快速定性和定量检测，但无法进行精确的定量分析。余慧等[60]以整体柱为基底的SERS法快速检测和表征混合色素和加标茶饮料样品中的柯衣定。

综上所述，文章总结了常见色素的定性定量检测方法，包括色谱法（高效液相色谱法、高效气相色谱法、薄层色谱法、超临界流体色谱法）、电化学分析方法（示波极谱法、毛细管电泳）和光谱法（分光光度法、荧光光谱法、近红外光谱法、表面增强拉曼光谱法）等检测方法，每种方法各有优势。从时间进程上看，色素检测由传统的色谱技术、电化学分析向光谱的方向发展，在准确的同时追求快速、高效，从而为市场检测提供基础。

食品工业化的发展离不开添加剂的使用，起着色功能的人工色素在饮料、糕点等食品中使用颇多，生产者过量或使用非法人工色素将威胁消费者的身体健康，造成巨大的社会问题。市场监督人员对市面上的食品进行色素检测的同时，快速、高效、简便、微量准确的方法正是所需。光谱检测的研究近来为这种需求提供可能。

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